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黒田メソッド

黒田メソッドによる高精度な精子品質(精子機能)検査

黒田メソッドによる高精度な精子品質 (機能) 検査

黒田メソッドによる精子精密検査

1.  精子の先体反応 (精子の卵子接着機能) の解析

 先体は精子頭部の前半部を覆う袋状の小器官で、その中には卵子に侵入する際に必要な加水分解酵素が入っています。この酵素が卵子と接着するときに放出されることにより、精子が卵子に侵入できるようになります。この一連の仕組みを「先体反応」と言いますが、言い換えれば、先体反応を起こすことができた精子が卵子に接着して侵入できるということです。ですから、顕微授精に穿刺注入する精子は、先体反応を起こすことができた精子が選ばれることが必須になります。この先体反応の発現機構は、私の博士論文のテーマですから、いわば「黒田メソッドの原点」ともいえるものです。

 先体反応、すなわち精子の卵子接着機能の検査では、運動している (生存確認できる) 精子において、1. まず 先体があるかないかを確認すること、2. 次いで 先体に孔が開き、先体の内側の膜 (先体内膜) が露出したかしないか (先体反応を起こしたか起こしていないか) を観察しなくてはなりません。

 下図1 では、人工的に赤く着色した先体部分が、先体反応を起こしていく過程で外れていく (赤い部分が剥がれていく) 様子がご理解いただけると思います。

 下図2 は、黒田メソッドにより分離した先体反応を起こす前の (先体が外れる前の) 精子の先体部分を緑色で、核部分を赤色で特殊染色したものです。

先体反応

図1 先体反応を起こしていく過程

蛍光顕微鏡像

図2 先体を緑、核を赤で特殊染色

(「不妊治療の真実」幻冬舎より)

 私は、先体の解剖学的な特性を利用して、精子の生存性を確保したまま先体反応の機能解析できる検査法 (コンカナバリンA法) を確立しました。本法は、先体反応により露出された先体内膜上に出現したアスパラギン結合高マンノース型糖鎖を、蛍光色素でラベル化したコンカナバリンAで組織化学的に特異染色した検出法です (下図3参照) 。

 下図3 は、黒田メソッドにより分離した先体反応を起こした後の (先体が外れた後の) 精子の蛍光染色像です。

 

コンカナバリンA

 

図3 先体反応を起こすことができた精子の蛍光染色像

 

2.  精子のDNA構造正常性の解析- DNA損傷をどのように観察するのか

 DNA損傷には いろいろあり、2重鎖切断、片側開裂、酸化的損傷、化学物質による塩基修飾など多様です。その中でも、最も細胞致死性が高くなるDNA 損傷は、言い換えれば 最も修復が困難となるDNA損傷は、2重鎖切断です。そこで、ARTにおける精子品質管理の観点から 安全なARTを目指すには、個々の精子の非特異的DNA 損傷、とくにDNA2重鎖切断の初期段階を定量的に検出する方法の確立が必須です。

 これまで数種類のDNA断片化検査法が報告され、受精率、妊娠率、流産率などの臨床結果との相関が報告されてきましたが、これらはDNA切断の初期段階の検出には不向きでした。そこで、私の精子研究班では、電気泳動法によりDNA断片の長さおよび数を泳動度の差、断片量として定量的に検知できることに着目し、個々の精子における核DNA断片化を高精度に検出できる方法を確立しました。

 下図1 は、高精度に選別した高品質の運動精子 (DNA非損傷精子) の電気泳動像です。数十本の均一なDNAファイバーが連続性に伸張しています。一方、下図2 は、DNAが高度に損傷した精子 (DNA損傷精子) の電気泳動像です。DNAファイバーの連続性がなく、切断されて顆粒状に見えます。

 

高品質の運動精子(DNA非損傷精子)の電気泳動像

 

図1 DNA非損傷精子

高度に損傷した精子(DNA損傷精子)の電気泳動像

 

図2 DNA損傷精子

3. 精子中片部の評価

 精子頭部と尾部をつなぐ首の部分を精子中片部といいます。そこにはエネルギー (ATP、詳細は省きます) を産出するミトコンドリアが存在し、主として精子運動との関連が指摘されていますが、この中片部には胚分割に重要な役割を果たす中心体と呼ばれる小器官も存在することから、中片部形態が卵子分割に影響することも研究されています。

 私は、精子中片部の形態観察は、精子運動のみならず胚分割に重要な意味を持つ可能性も踏まえ、精子精密検査の項目に加えております。射精精子の中片部の形状は様々ですが、下図のように 高度に選別した運動精子では 細く真っ直ぐな形状をしたものがほとんどです。

 

 

精液中の精子



4. 精子頭部空胞の評価

 精子頭部形態 (頭部外周形状) が楕円で正常な形状をしている精子の中にも、先体の下の部分に穴が開いている状態のもの (頭部空胞化精子) も含まれています (以下の図1・2・3を参照ください) 。私の精子研究班では、精子頭部の空胞化している部分のDNA密度が低いことを明らかにしましたが、頭部空胞とDNA損傷との因果関係は不明です。その詳細に関しましては現在研究中ですが、黒田メソッドとして精子精密検査の項目に加えております。ここでは、見かけだけでは精子品質 (機能) を評価することはできないということを繰り返し強調したいと思います。

 下図1は、広く用いられている染色法ですが、あくまでも精子頭部形態を観察することだけを目的としている染色法ですので、先体や頭部空胞を観察することはできません。

 下図2は、黒田メソッドを用いて 先体反応を起こす前の (先体を有している) 精子を選別したものを染色したものです。精子頭部の前半部をcap状に覆っている先体部のほとんどが染色されていることからも、先体を有した先体反応未誘起精子が分離精製されていることが確認できます。

 下図3は、新たに開発した希薄染色法を用いて、精子頭部空胞を観察したものです。図2と図3は、同一視野、すなわち同じ精子を示しております。図2に お示しした精子頭部形態は非常に良好であり、先体の状態も同様に良好でしたが、図3から この方では高い頻度で頭部に空胞を認めることが解ります。
 この結果は、精子頭部空胞の数や大きさ、またその割合は やはり個人差が大きく、楕円形の正常頭部形態を有した運動良好な精子であっても、頭部空胞がある場合があることを示しております。すなわち、頭部形態が正常な運動精子であれば良好精子とみなす、従来の精子評価指標では不十分 (不適切) であることを示しております。だからこそ、「精子形態」と「精子機能」を詳細に調べることが重要であることが ご理解いただけたことと思います。

 


図1

図1 精子頭部形態のみ観察可能な染色法であり

先体や頭部空胞の観察は不可能な染色法

 

図2

 

図2 図3と同一視野

先体反応を起こす前の (先体を有している) 精子の染色像

図3

 

図3 図2と同一視野

精子頭部形態が非常に良好 (図2) でも

多数の頭部空胞 (図3) を有している

 

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